Educação em Microscopia e Imagem Digital

por **Admin** Sáb Mar 05, 2022 4:34 pm

Introdução
No microscópio óptico, quando a luz de uma fonte de iluminação passa pelo condensador e depois pela amostra, parte da luz passa ao redor e através da amostra sem ser perturbada em seu caminho. Essa luz é chamada de direta , não desviada ou não difratada.luz e representa a luz de fundo. Parte da luz que interage com a amostra é desviada ou difratada. A luz difratada é processada em meio comprimento de onda ou 180 graus fora de fase com a luz direta que passou sem encontrar obstáculos. A defasagem de meio comprimento de onda, causada pela própria amostra, permite que essa luz cause interferência destrutiva com a luz direta quando ambas chegam ao plano de imagem intermediário localizado no diafragma fixo da ocular. A lente ocular da ocular amplia ainda mais essa imagem, que finalmente é projetada na retina, no plano do filme de uma câmera ou na superfície de um sensor de imagem digital sensível à luz.

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O que aconteceu é que a luz direta ou não desviada é projetada pela objetiva e espalhada uniformemente por todo o plano da imagem no diafragma da ocular. A luz difratada pela amostra interfere no plano focal traseiro objetivo (ver Figura 1) e é focalizada em vários pontos localizados no mesmo plano da imagem, onde a luz difratada causa interferência destrutiva e reduz a intensidade, resultando na geração de um padrão contendo um amplo espectro de valores de escala de cinza que variam de muito escuro a muito claro. Esses padrões de luz e escuridão são o que reconhecemos como uma imagem do espécime. Como nossos olhos são sensíveis às variações de brilho, a imagem torna-se uma reconstituição mais ou menos fiel do espécime original.
Para ajudar a entender os princípios básicos da formação da imagem, sugere-se que o leitor tente o seguinte exercício e use um objeto de estrutura periódica conhecida como espécime. Esses experimentos são mais fáceis de realizar usando um micrômetro de palco ou grade similar de linhas escuras muito próximas. Para prosseguir, coloque a grade finamente pautada na platina do microscópio e coloque-a em foco usando primeiro uma objetiva de 10x e depois a de 40x. Retire a ocular e, em seu lugar, insira um telescópio de fase para que o plano focal traseiro da objetiva possa ser observado. Se o diafragma de abertura do condensador estiver totalmente fechado, um ponto de luz central branco brilhante aparecerá na parte de trás da objetiva, que é a imagem do diafragma de abertura. À direita e à esquerda do ponto central, uma série de espectros de difração (também imagens do diafragma de abertura; apresentados na Figura 1) estarão presentes, cada um colorido de azul na parte mais próxima do ponto central e colorido de vermelho na parte do espectro mais distante do ponto brilhante central (como ilustrado na Figura 2). A intensidade desses espectros coloridos diminui de acordo com a distância do espectro do ponto central.

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Aqueles espectros de difração que caem perto da periferia do objetivo são mais escuros do que aqueles mais próximos do ponto central. Os espectros de difração ilustrados na Figura 2 foram capturados usando três ampliações objetivas diferentes. Na Figura 2(b), o padrão de difração visível no plano focal traseiro da objetiva de 10x contém dois espectros de difração. Se a grade for removida da platina, conforme ilustrado na Figura 2(a), esses espectros desaparecem e apenas a imagem central do diafragma de abertura permanece. Se a grade for reinserida, os espectros reaparecem mais uma vez. Observe que os espaços entre os espectros coloridos aparecem escuros. Apenas um único par de espectros pode ser observado se a grade for examinada com a objetiva de 10x. Nesse caso, um ponto de difração aparece à esquerda e outro aparece à direita da abertura da abertura central. Se a grade de linha for examinada com uma objetiva de 40x (como mostrado na Figura 2(c)), vários espectros de difração aparecem à esquerda e à direita da abertura central. Quando a ampliação é aumentada para 60x ou 63x (e supondo que tenha uma abertura numérica maior do que a objetiva de 40x), vários espectros adicionais (veja a Figura 2(d)) aparecem à direita e à esquerda daqueles que são visíveis com a objetiva de 40x no lugar.
Como os espectros coloridos desaparecem quando a grade é removida, pode-se supor que é a própria amostra que está afetando a luz que passa, produzindo assim os espectros coloridos. Além disso, se o diafragma de abertura for fechado para um tamanho de abertura muito pequeno, observaremos que objetivas de maior abertura numérica captam mais desses espectros coloridos do que objetivas de menor abertura numérica. A importância crucial desses dois conceitos para a compreensão da formação da imagem ficará clara nos parágrafos seguintes. O ponto central de luz (imagem do diafragma de abertura do condensador) representa a luz direta ou não desviada que passa pela amostra ou ao redor da amostra sem ser perturbada (ilustrado na Figura 3(b)). É chamado de 0 ou zeropedido. As imagens mais fracas do diafragma de abertura em cada lado da ordem zero são chamadas de 1ª, 2ª, 3ª, 4ª, etc. ordens respectivamente, conforme representado pelo padrão de difração simulado na Figura 3(a), que seria observado na plano focal traseiro de uma objetiva de 40x. Todas as ordens capturadas representam, neste caso, o padrão de difração da grade de linha visto no plano focal traseiro da objetiva.

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As imagens difratadas mais fracas do diafragma de abertura são causadas por frentes de onda difratadas, espalhadas em forma de leque, em cada uma das aberturas da grade de linha (Figura 3(b)). Os comprimentos de onda azuis são difratados em um ângulo menor que os comprimentos de onda verdes, que são difratados em um ângulo menor que os comprimentos de onda vermelhos. No plano focal traseiro da objetiva, os comprimentos de onda azuis de cada fenda interferem construtivamente para produzir a área azul da imagem difratada de cada espectro ou ordem. As áreas vermelha e verde (Figura 3(a)) estão um pouco mais espaçadas, mas surgem do mesmo fenômeno. Onde os comprimentos de onda difratados são meia onda fora de sincronia para cada uma dessas cores, as ondas interferem destrutivamente para dar origem às áreas escuras entre os espectros ou ordens. Na posição de ordem zero, todos os comprimentos de onda de cada fenda somam construtivamente. Isso produz a luz branca brilhante que você vê na ordem zero (veja as Figuras 2, 3 e 4) no centro do plano focal traseiro da objetiva.

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Quanto mais próximo for o espaçamento de uma grade de linhas, menos espectros serão capturados por uma determinada objetiva, conforme ilustrado na Figura 4(ac). O padrão de difração ilustrado na Figura 4(a) foi capturado por uma objetiva de 40x imageando a porção inferior da linha de grade na Figura 4(b), onde as fendas estão mais próximas. Na Figura 4(c), a objetiva está focada na porção superior da grade de linha (Figura 4(b)), onde as fendas estão mais afastadas e mais espectros são capturados pela objetiva. A luz direta e a luz dos máximos de difração de ordem superior são focalizadas pela objetiva para formar uma imagem no plano de imagem intermediário no diafragma fixo da ocular. Aqui os raios de luz diretos e difratados interferem e são assim reconstituídos no real, imagem invertida que é vista pela lente do olho da ocular e ampliada ainda mais. Isso é ilustrado na Figura 4(d) até a Figura 4(g) com dois tipos de grades de difração. A grade quadrada ilustrada na Figura 4(d) representa a imagem ortoscópica da grade (na verdade, a imagem de amostra usual observada através das oculares) vista através da abertura total da objetiva. O padrão de difração derivado desta grade é mostrado como uma imagem conoscópica que seria vista no plano focal traseiro da objetiva (Figura 4(e)). Da mesma forma, a imagem ortoscópica de uma grade disposta hexagonalmente (Figura 4(f)) produz uma imagem conoscópica disposta hexagonalmente correspondente (Figura 4(g)) de padrões de difração de primeira ordem. A grade quadrada ilustrada na Figura 4(d) representa a imagem ortoscópica da grade (na verdade, a imagem de amostra usual observada através das oculares) vista através da abertura total da objetiva. O padrão de difração derivado desta grade é mostrado como uma imagem conoscópica que seria vista no plano focal traseiro da objetiva (Figura 4(e)). Da mesma forma, a imagem ortoscópica de uma grade disposta hexagonalmente (Figura 4(f)) produz uma imagem conoscópica disposta hexagonalmente correspondente (Figura 4(g)) de padrões de difração de primeira ordem. A grade quadrada ilustrada na Figura 4(d) representa a imagem ortoscópica da grade (na verdade, a imagem de amostra usual observada através das oculares) vista através da abertura total da objetiva. O padrão de difração derivado desta grade é mostrado como uma imagem conoscópica que seria vista no plano focal traseiro da objetiva (Figura 4(e)). Da mesma forma, a imagem ortoscópica de uma grade disposta hexagonalmente (Figura 4(f)) produz uma imagem conoscópica disposta hexagonalmente correspondente (Figura 4(g)) de padrões de difração de primeira ordem. O padrão de difração derivado desta grade é mostrado como uma imagem conoscópica que seria vista no plano focal traseiro da objetiva (Figura 4(e)). Da mesma forma, a imagem ortoscópica de uma grade disposta hexagonalmente (Figura 4(f)) produz uma imagem conoscópica disposta hexagonalmente correspondente (Figura 4(g)) de padrões de difração de primeira ordem. O padrão de difração derivado desta grade é mostrado como uma imagem conoscópica que seria vista no plano focal traseiro da objetiva (Figura 4(e)). Da mesma forma, a imagem ortoscópica de uma grade disposta hexagonalmente (Figura 4(f)) produz uma imagem conoscópica disposta hexagonalmente correspondente (Figura 4(g)) de padrões de difração de primeira ordem.

voltar ao topo ^Luz difratada e resolução
As amostras de microscópio podem ser consideradas como grades complexas de linhas ou padrões com detalhes e aberturas que abrangem uma grande variedade de tamanhos. Este conceito de formação de imagem foi amplamente desenvolvido por Ernst Abbe, o famoso microscopista e teórico da óptica alemão do século XIX. Segundo Abbe (suas teorias ainda são amplamente aceitas na atualidade), os detalhes de um espécime serão resolvidos se a objetiva capturar 2 ordens de luz, como a ordem 0 da luz e pelo menos a ordem 1 da difração. Quanto maior o número de ordens difratadas que ganham admissão ao objetivo, mais precisamente a imagem representará o objeto original. Além disso, se um meio de índice de refração mais alto que o ar (como óleo de imersão) for usado no espaço entre a lente frontal da objetiva e a parte superior da lamínula (como mostrado para uma objetiva seca na Figura 5(a)), o o ângulo das ordens difratadas é reduzido e os leques de luz difratada serão comprimidos. Como resultado, uma objetiva de imersão em óleo pode capturar mais ordens difratadas e produzir melhor resolução do que uma objetiva seca (Figura 5(b)). Compare os pedidos capturados na Figura 5(a) e 5(b). Além disso, como a luz azul é difratada em um ângulo menor do que a luz verde ou a luz vermelha, uma lente de uma determinada abertura pode capturar mais ordens de luz quando os comprimentos de onda estão na região azul do espectro de luz visível.

d (resolução) = 1,22 • (λ / 2NA) (1)

onde d é o espaço entre duas partículas adjacentes (ainda permitindo que as partículas sejam percebidas como separadas), λ é o comprimento de onda da iluminação e NAé a abertura numérica da objetiva. Supõe-se que o microscópio também esteja equipado com um condensador com a mesma abertura numérica da objetiva (sem um condensador, a resolução seria metade da boa, resultando em detalhes resolvidos duas vezes maiores). Quanto maior o número de ordens difratadas mais altas admitidas na objetiva, menores serão os detalhes do espécime que podem ser claramente separados ou resolvidos. Aqui está o valor de usar objetivas de alta abertura numérica para examinar os menores detalhes possíveis em vários espécimes. Da mesma forma, quanto menor o comprimento de onda da luz visível usada, melhor a resolução. Essas ideias explicam por que as lentes apocromáticas de alta abertura numérica podem separar detalhes extremamente pequenos na luz azul. Colocar uma máscara opaca na parte de trás do objetivo bloqueia as ordens difratadas mais externas. Isso reduz a resolução das linhas de grade ou quaisquer outros detalhes da amostra, ou destrói a resolução completamente para que a amostra não fique visível. Daí o cuidado usual para não fechar o diafragma de abertura do condensador abaixo dos dois terços sugeridos da abertura da objetiva.

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A falha do objetivo em captar mais de uma das ordens difratadas resulta em uma imagem não resolvida. Em uma amostra com detalhes muito minuciosos, os ventiladores de difração são espalhados em um ângulo muito grande, exigindo uma objetiva de alta abertura numérica para capturá-los. Da mesma forma, como os ventiladores de difração são comprimidos em óleo de imersão ou em água, as objetivas projetadas para tal uso podem dar melhor resolução do que as objetivas secas. Se ordens difratadas alternadas forem bloqueadas (ainda assumindo a grade como nosso espécime), o número de linhas na grade aparecerá dobrado (uma resolução espúria). A ressalva importante é que as ações introduzidas na parte traseira do objetivo realmente determinam a eventual imagem produzida. Para pequenos detalhes em uma amostra (em oposição a uma grade de linha), a objetiva projeta a luz direta e difratada no plano da imagem do diafragma da ocular na forma de pequenos padrões de difração circulares conhecidos como discos de Airy (ilustrados na Figura 6). As objetivas de alta abertura numérica capturam mais ordens difratadas e produzem discos de tamanho menor do que as objetivas de baixa abertura numérica. Na Figura 6, o tamanho do disco Airy é mostrado diminuindo constantemente da Figura 6(a) até a Figura 6(c). Os tamanhos de disco maiores nas Figuras 6(a) e (b) são produzidos por objetivas com abertura numérica mais baixa, enquanto o disco de Airy muito nítido na Figura 6(c) é produzido por uma objetiva de abertura numérica muito alta. As objetivas de alta abertura numérica capturam mais ordens difratadas e produzem discos de tamanho menor do que as objetivas de baixa abertura numérica. Na Figura 6, o tamanho do disco Airy é mostrado diminuindo constantemente da Figura 6(a) até a Figura 6(c). Os tamanhos de disco maiores nas Figuras 6(a) e (b) são produzidos por objetivas com abertura numérica mais baixa, enquanto o disco de Airy muito nítido na Figura 6(c) é produzido por uma objetiva de abertura numérica muito alta. As objetivas de alta abertura numérica capturam mais ordens difratadas e produzem discos de tamanho menor do que as objetivas de baixa abertura numérica. Na Figura 6, o tamanho do disco Airy é mostrado diminuindo constantemente da Figura 6(a) até a Figura 6(c). Os tamanhos de disco maiores nas Figuras 6(a) e (b) são produzidos por objetivas com abertura numérica mais baixa, enquanto o disco de Airy muito nítido na Figura 6(c) é produzido por uma objetiva de abertura numérica muito alta.

Educação em Microscopia e Imagem Digital Imageformationfigure6

A imagem resultante no nível do diafragma da ocular é na verdade um mosaico de discos de Airy que são percebidos como regiões claras e escuras da amostra. Onde dois discos estão tão próximos que seus pontos brilhantes centrais se sobrepõem consideravelmente, os dois detalhes representados por esses discos sobrepostos não são resolvidos ou separados e, portanto, aparecem como um (ilustrado na Figura 6(e)). Em contraste, os discos Airy mostrados na Figura 6(d) estão distantes o suficiente para serem resolvidos. O princípio básico a ser lembrado é que a combinação de luz direta e difratada (ou a manipulação de luz direta ou difratada) é extremamente importante na formação da imagem. Os locais-chave para tal manipulação são o plano focal traseiro da objetiva e o plano focal frontal do condensador. Este princípio é fundamental para a maioria dos métodos de melhoria de contraste em microscopia óptica. Mais importante, é de particular importância na alta ampliação de pequenos detalhes de tamanho próximo ao comprimento de onda da luz. Ernst Abbe foi um pioneiro no desenvolvimento desses conceitos para explicar a formação de imagens de absorção de luz ouamplitude specimens.